ICS65.020.30 CCSA0311 NAASS 宁夏回族自治区农学会团体标准 T/NAASS057—2023 牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验 抗体检测技术规程 TechnicalspecificationfordetectionofindirectELISAantibodiestobovine herpesvirustype4 2023-03-22发布 2023-04-25实施 宁夏回族自治区农学会  发布 全国团体标准信息平台 T/NAASS057—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 专利免责申明：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏回族自治区科学技术厅提出。 本文件由宁夏回族自治区农学会归口。 本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、宁夏回族自治区畜牧工作站、同心县动 物疾病预防控制中心、固原市农产品质量安全监管中心、宁夏农林科学院动物科学研究所。 本文件主要起草人：李知新、周海宁、邸静、尹才、封元、赵燕、闫小芹、左新文、常耀祖、吴建 宁、张学军、李莉娟、王磊、梁小军、郭亚男、王博、王晓亮。 全国团体标准信息平台 T/NAASS057—2023 1牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术规程 1范围 本文件规定了牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测的术语和定义、间接酶联免疫吸附试 验。 本文件适用于牛血清、牛血浆、牛奶样本中牛4型疱疹病毒病抗体的检测，可用于该病的实验室检 测、诊断和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛4型疱疹病毒Bovineherpesvirus4，BoHV-4 牛4型疱疹病毒属于疱疹病毒科丙型疱疹病毒亚科猴病毒属，是导致牛生殖障碍的主要病毒之一。 3.2 间接酶联免疫吸附试验Indirectenzymelinkedimmunosorbentassay,iELISA 间接ELISA方法是先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测，首先加入检测抗体与抗原特异 性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色,由呈色反应来测定抗原。 4间接酶联免疫吸附试验操作 4.1试验准备 实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定 执行。实验环境的生物安全条件应符合GB/T19489的要求，稀释用蒸馏水应符合GB/T6682的要求。 4.2检测样品 4.2.1新鲜或冷冻的血清、血浆、奶样均可直接用于检测。 4.2.2奶样准备：4000rpm/min离心20min，利用巴斯德吸管吸取中间层液体，注意不要接触到下层 的细胞沉淀物。未稀释的脱脂奶可直接加入微孔板。 4.3操作程序 使用前将所有试剂恢复至21℃±3℃，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。 4.3.1准备 取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测 样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2℃～8℃保存。 4.3.2血清或血浆稀释 血清或血浆按试剂盒要求稀释，避免使用溶血样品和具有凝结物的样品。在试剂盒的微孔板中按要 求加入样品、稀释液，吹打混匀。 全国团体标准信息平台 T/NAASS057—2023 24.3.3对照样品（阳性血清和阴性血清）和示踪剂稀释 阳性血清、阴性血清及示踪剂应用稀释液按试剂盒要求进行稀释。 4.3.4加样 每孔加入样品（血清、血浆或奶样），一孔一样。阳性血清加入A1孔，阴性血清加入A2孔，示踪剂 加入A3孔，样品1加入A4孔，以此类推。 4.3.5感作 将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。 4.3.6洗涤 弃去微孔板中液体，用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中 的液体，在洗涤时以及在加入下一步试剂之前要防止反应板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后 一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。 4.3.7稀释酶结合物 将酶结合物用稀释液按要求进行稀释。 4.3.8加酶结合物 每孔加入酶结合物，摇匀。将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育，按步 骤4.3.6进行洗涤。 4.3.9加底物 每孔加入底物溶液。按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。 4.3.10加终止液 每孔加终止液终止反应。 4.3.11测定吸光值（OD值） 酶标仪预热15min，在加入终止液5min内读取试剂盒说明书中指定波长的吸光度值。 4.4实验有效性检测 只有当满足试剂盒说明书规定的条件时检测才有效。 4.5结果计算 使用试剂盒说明书指定的计算公式进行结果计算。 4.6结果判定 使用试剂盒说明书规定的判定标准进行结果判定。 全国团体标准信息平台